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拮抗放线菌LH179筛选和初步鉴定
添加时间: 2010-1-23 10:43:04 文章来源: 文章作者: 点击数:3109
 
(西北农林科技大学 植物保护学院 陕西 杨凌 712100)
[摘  要]:采用常规方法从陕西杨凌大寨乡附近,乾县苹果地土壤中筛选出1株对多种病原真菌具有拮抗作用的放线菌LH179。通过传统的形态特征和部分生理生化测定,这株拮抗放线菌属链霉菌属的白孢类群.离体条件下这株拮抗放线菌的发酵液对水稻稻瘟病原菌,番茄早疫病病原菌,番茄灰霉病病原菌,番茄赤霉病病原菌,梨黑星病病源菌,小麦全蚀病病原菌,茄褐纹病病原菌,玉米大斑病原菌,棉花枯萎病病原菌,黄瓜灰霉病病原菌,苹果腐烂,石榴干腐,黄瓜炭疽、西瓜枯萎等10 种病原真菌均具有抑制作用.
[关 键 词]:拮抗放线菌;筛选;鉴定
[中图分类号]:S432.4+3 文献标识码:A
 
Preliminary Identification and Classification of Soil Antagonistic Actinomycetes LH179
LIU HUAN1,AN DE RONG2
(1.Insitute of Plant Protection NUWSUAF,Yangling,712100,China)
Abstract: One strains antagonistic Actinomycetes from three vegetable fields was identified and classified by using routine methods.The results showed that this strain were classified into the genus of Streptomyces,the further detection of physiological and biochemical characteristics revealed that the strain belonged to Albosporus.The result also showed that the fermentation extract from this strain antagonistic Actinomyces had a fungicidal activity to
Verticillium dahliae Kleb,Physalospora piriclola,Colletotrichum lagenarium,Rhizoctonia solani,Botrytis cinerea,Gibberlla zeae,Fusarim oxysporium f.cucumerinum,Fusarim oxysporium f.niveum.
Key words: antagonistic Actinomycetes;identification;classification
放线菌(Actinomycetes)资源作为一种具有巨大经济潜力的微生物资源日益受到国内外学者的关注[1]。如其中链霉菌(Streptomyces)作为一种植物根圈促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)在相关文献[2]就有大量报道。另外,自1930年世界第一种抗生素即膏霉亲批量生产以来,全世界已有90 多种已被大量生产与应用[3],数千种抗生素及其衍生物被开发出来。就已知的抗生素而言,80%是由放线菌产生的[4]。土壤作为微生物良好的生活环境,生存着大量具有相互拮抗作用的微生物.在生防菌株的筛选上,考虑到植物与微生物之间的相互关系,人们把生防菌株的研究重点放在从植物根表面或根圈土壤中筛选,这样筛选出来的微生物接种后,在根表面具有很好的定殖能力[5].其中拮抗放线菌广泛存在,利用放线菌制备出的抗生素类新型绿色农药已成为无公害农药的主体.近几年,世界各国对放线菌的研究与资源开发极为重视[3],农用抗生素的筛选和应用已成为学术界的研究重点。轮作土壤生态环境多样,放线菌资源丰富.笔者以2 种轮作土壤为材料,以番茄灰霉菌为指示菌,对其中的放线菌进行了分离,并对分离所得到的1 株拮抗菌株的分类地位和发酵液的抗菌谱进行了研究,现将结果报道如下.
秦巴山区位于陕西省南部, 为我国南北气候的过渡区域, 地域面积广,地形、地势复杂, 海拔垂直差异大, 一般在 170-2 960 m。本实验从秦巴山区土壤中筛选出一株放线菌,同时进一步通过对国内的10种植物病原真菌的体外拮抗实验,以期获得有较好防治效果的生防菌。从而为秦巴山区土壤环境放线菌资源研究、利用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1材  料
1.1.1供试土样:2006年9月在雨后4-5天的轮作地里取样250-350g,一个地点采多个样本,混合过筛,置于4℃冰箱内保存待分离。采集土样时, 先用小铲除去表土, 取5~10 cm 处的土壤,分装入塑料袋中, 放入标签后带回实验室分离。若短时间内不能分离, 则应将土样晾干, 置于阴凉处保存, 切勿使土壤变潮生霉。土壤样品均由西北农林科技大学植病站提供
1.1.2供试菌种:
(1)放线菌:供试的拮抗放线菌均是通过对病原真菌的平皿抑制实验中筛选所得。
(2)靶标菌:均为真菌,于PDA斜面培养,4℃保存。水稻稻瘟病原菌(Pyricularia oryzae),番茄早疫病病原菌(Alternaria solani),番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea),梨黑星病病原菌(Venturia nashicola),小麦全蚀病病原菌(Gaeumannomyces graminis),茄褐纹病病原菌(Phomopsis Vexans),玉米大斑病病原菌(Exserohilum turcicum),棉花枯萎病病原菌(Fusaxium oxysporium),小麦赤霉(Fusarium graminearum),均由西北农林科技大学植病实验站提供。
1.1.3培养基:高氏一号琼脂培养基(GA)马铃薯浸汁培养基(PDA);优化后的液体发酵培养基:黄豆饼粉10g(适量蒸馏水煮沸0.~1h,取滤液),葡萄糖10g,蛋白胨3g ,氯化钠2.5g,碳酸钙2g,纯水1000ml配成溶液,调pH7~8。
1.2拮抗放线菌分离:采用稀释法进行分离[7].[7] 程光胜.微生物学实验法[M].北京:科学出版社,1981.将纯化的单菌落转接到高氏一号斜面上培养后, 编号保存。
1.3拮抗放线菌初筛:
皿内平板十字交叉法进行拮抗菌株初筛,筛选出对水稻稻瘟病原菌,番茄早疫病病原菌,番茄灰霉病病原菌,梨黑星病病源菌,小麦全蚀病病原菌,茄褐纹病病原菌,玉米大斑病病原菌,棉花枯萎病病原菌,小麦赤霉病原菌有拮抗活性的菌株,活化保存于高氏一号培养基上。
1.4液体发酵复筛:
1.4.1发酵液的制备。将初筛得到的8株放线菌菌株进行发酵液复筛, 将各菌株斜面菌种孢子用无菌水洗涤, 在无菌管中配成菌悬液, 振荡成均匀的菌悬液, 孢子最终浓度约为104 个/ml[]。按10%接种量接入发酵培养基, 然后置于28 ℃、转速150 r/min 的恒温摇床上培养5 d[3]
 3 Jose R T, Juan B G, Mar D A. A method for the selection of production media for actinemycete strains based on their metabolite HPLC profiles[J].J Ind MicrobiolBiotechsol,2003,30:582- 588.
。测定时, 取15 ml 于6 000 r/min 离心15 min, 取上清液进行抑菌活性测定[2] 2 赵斌, 何绍江.微生物学实验[M].北京: 科学出版社, 2002.86.
1.4.2放线菌发酵液对病原菌抑菌活性测定方法
 以水稻稻瘟病菌为指示菌, 采用生长速率法测定抑菌活性。取发酵液1 ml, 注入培养皿中, 然后将冷却至50 ℃左右的培养基9 ml 倒入培养皿中, 混合均匀, 冷却后接病原菌菌饼,以不加发酵滤液的PDA 平板上生长的病原菌菌落直径为对照。3 d 后测量菌落直径, 重复3 次。通过公式: 抑制率( %) =(对照菌落直径- 处理菌落直径)/对照菌落直径×100%
1.5单孢菌发酵液对植株生长的促进作用
1.5.1单孢分离:选择复筛中颉颃性较好的菌株进行单孢分离。用生长素率法测定24小时、48小时的发酵液对病原菌的抑制率。从而筛选出最优良的菌株。
1.5.2将单孢菌发酵液接入土壤中播种,45d后测量株高、根长、叶面积和植株鲜重,分析放线菌对植株生长的促进作用。
2 结果与分析
2.1 土壤放线菌分离
从2份土样中共分离到198株放线菌。将菌株纯化后试管保存。
2.2 拮抗菌筛选
2.2.1初筛实验结果:采用皿内平板十字交叉法对分离到的198株放线菌进行初筛,筛选到对水稻稻瘟病原菌等10种病原菌有拮抗性的放线菌8株。结果见表1
表1 拮抗菌的分离和初筛结果(单位:mm)
Table 1 Result of screening antagonistic Actinomyces
 
靶标菌
Target pathogen
菌株号
number
水稻稻瘟
P. oryzae
番茄早疫
A. solani
梨黑星
V. nashicola
棉花枯萎
F.oxyspovrium
小麦赤霉
F. graminearum
番茄灰霉
B. cinerea
茄褐纹
P. Vexans
小麦全蚀
G. graminis
玉米大斑
E. turcicum
15号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
37号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
39号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40号
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41
 
 
 
 
 
 
 
 
 
168
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“—”表示抑菌圈相对半经小于5mm
2.2.2拮抗菌的复筛实验结果
对初次筛选到的10株颉颃放线菌进行复筛,通过生长素率法测定发酵滤液对病原菌的抑制率。结果其中的5株放线菌拮抗性不明显或丧失了拮抗性,另外5株有潜力的放线菌33、34、39、40、168对供试病原菌的抑制效果如表2所示,其33号菌株对水稻稻瘟、小麦赤霉的抑制率在90%以上,对六种病原菌的整体抑制效果优于其它菌株。
表2 生长速率法测定发酵液(100ml/l)对病原菌的抑制率(%)
Table 2
菌株号
供 试 病 原 菌
水稻稻瘟
小麦赤霉
棉花枯萎
番茄灰霉
玉米大斑
小麦全蚀
34
40
0
67
51
36
52
33
94
90
76
67
52
84
39
61
50
4
44
82
61
40
77
50
39
61
47
43
168
98
67
48
64
63
51
2.3单孢菌的筛选结果
通过颉颃菌的复筛,选到了一株颉颃性最好的放线菌株33号。对33号菌株进行单胞分离,得到5株单孢菌33-01、33-02、33-03、33-04、33-05,对这5株单孢菌进行发酵培养,用生长素率法测定24小时、48小时的发酵滤液对病原菌的抑制率,得到如下结果:(如表3.6)
表5 24h、48h单孢菌发酵液(50 ml/l)皿内测定抑制率(%)
单孢菌株
供 试 病 原 菌
水稻稻瘟
24h 48h
小麦全蚀
24h 48h
棉花枯萎
24h 48h
番茄灰霉
24h 48h
小麦赤霉
24h 48h
茄褐纹
24h 48h
33-01
100 81
85 53
65  62
37  61
39  19
84  80
33-02
100 81
85 75
78  72
16  27
58  41
84  82
33-03
68 65
50 24
70  60
72  65
8   9
53  61
33-04
63 59
80 48
75  75
69  86
28  24
86  84
33-05
100 90
92 72
78  75
86  71
56  27
85  83
5个单孢菌的发酵滤液对6种病原菌的抑制效果差异较大,从表5可以看出:33-02号单孢菌几乎丧失了对番茄灰霉的颉颃性,33-05单孢菌发酵滤液对小麦赤霉的抑制率小于10%。从整体比较,33-03号菌株对六种病原菌的的抑制效果最好,其中对水稻稻瘟病菌在24h的抑制率达到了100%,48h抑制率为90%,对其它病原菌的抑制效果也优于另外4株单孢菌或与它们相当。 因此选定33-03号单孢菌株作为最终筛选到的一株效果最好的颉颃菌株。并命名为LH-33-03。
 
生长速率法:
日期
CK
1
2
3
4.19
21.1
16.7/20.8%
17.2
19.1
4.20
53.1
24.8
21.7
33.6
4.21
80.1
37.4
35.3
45.6
4.22
82.5
45.7
41.6
50.2
4.23
85.2
51.5
46.8
59.3
 
孢子萌发试验:
2.4 LH-33-03粗提物的抑菌谱的测定
表6表明:LH-33-03粗提物的抑菌谱较广,其对供试的大多数病原真菌都有很好的抑制效果。其中对水稻稻瘟病菌、小麦全蚀病菌、番茄早疫病菌,梨黑星病菌,茄褐纹病病原菌,小麦赤霉病菌在低浓度也能达到较好的效果,1mg/l的药液抑制率在45%以上。
表3.17 S-159-05粗提物的抑菌谱
病原菌
抑制强度
100mg/l
10mg/l
1mg/l
水稻稻瘟病菌
Pyricularia grisea
+++
+++
++
小麦赤霉病菌
Fusarium graminearum
++
+
小麦全蚀病菌
+++
+++
++
梨黑星病菌
+
茄褐纹病病原菌
+++
+++
++
 
+++
++
++
棉花枯萎病菌
++
++
+
番茄灰霉病菌
Botrytis cirerea
+++
++
++
玉米大斑病菌
+++
+++
++
 
+++
+++
++
 
番茄早疫病菌
Alternaria solani
+
注: +++:抑制率(防效)=75%—100%         ++:抑制率(防效)=45%—75%
      + :抑制率(防效)=30%—45%           —:抑制率(防效)<30%
2.5 盆栽试验:
4叶期:30ml发酵液。叶面喷雾法(106CFU.ml-1)]接放线菌4天后接病,接病4天后接放线菌重复4次,14天后观察:长势萎缩,有倒伏现象
放线菌对番茄幼苗生长的影响
温室防病试验结果表明,不同的放线菌株对番茄幼苗生长的促进作用不同(表3) 。菌株LH-33-03对株高和叶面积都有明显的促进作用,增幅比均超过了50 %;对根长的促进作用较大,增幅比达到了46. 6 %;促进番茄幼苗各项形态指标的增幅比在40 %~50 %之间;对番茄植株鲜重的促进作用高于50 %。
表2  4 株放线菌的代谢产物对番茄灰霉病的温室防效
Table 2  Control effect of fermentation metabolite of 4
strains of actinomycetes on gray mold disease of tomato
                 表3  4 株放线菌的代谢产物对番茄生长的影响
Table 3  Effect of fermentation metabolite of 4 strains of actinomycetes on growth of tomato
3 小结与讨论
参考文献:
[1] Bakker P A H M,Bakker A W,Marugg J D,et
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[4] 王光华,周克善,张秋生,等.拮抗细菌BRF-1 对几
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