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小鼠8-细胞胚胎相关基因的显示及筛选
添加时间: 2010-4-29 15:58:58 文章来源: 文章作者: 点击数:3251
小鼠8-细胞胚胎相关基因的显示及筛选
SCREENING OF MOUSE 8 CELL EMBRYO STAGE-SPECIFIC GENES
 
 
 
 
 
 
 
 
目   录
 
 
摘要……………………………………………………………………………………1
关键词…………………………………………………………………………………1
1 前言…………………………………………………………………………………2
2 方法……………………………………………………………………………4
   2.1.差异基因的筛选……………………………………………………………4
   2.2基因的显示………………………………………………………5
   2.3基因的筛选…………………………………………………………6
3 结果…………………………………………………………………………………7  
4分析与讨论…………………………………………………………………………8
5 结论……………………………………………………………………………9 
参考文献 ……………………………………………………………………………11
致谢…………………………………………………………………… ……………12
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
湖南农业大学东方科技学院全日制普通本科生
毕业论文(设计)诚信声明
 
 
本人郑重声明:所呈交的本科毕业论文(设计)是本人在指导老师的指导下,进行研究工作所取得的成果,成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
 
 
 
 
                    毕业论文(设计)作者签名:
 
                                              年   月   日
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
小鼠8-细胞胚胎相关基因的显示及筛选
学  生:刘启章
指导老师:王乃东老师
(湖南农业大学东方科技学院,长沙 410128)
 
摘 要:DDD分析的方法又称差异展示,通过编辑在某种组织中表达的EST,与其他组织中的EST 库进行生物信息学分析,寻找新的组织特异性EST的方法。本研究瞄准此发育事件的时间点,采用美国国立生物技术信息中心(NCBI)中差异展示(DDD)分析方法,研究8细胞早期胚胎及4细胞胚胎的基因表达差异, 以此来寻找8 细胞期胚胎紧密化和囊胚的形成可能的相关基因及调控机制,利用DDD工具筛选8细胞胚胎基因,并分析哺乳动物早期胚胎发育中的8细胞期的基因表达变化,寻找4细胞期到8细胞期发育过程可能的相关基因,有助于了解其基因表达机制。
关键词:差异展示;早期胚胎;基因
 
SCREENING OF MOUSE 8 CELL EMBRYO STAGE-SPECIFIC GENES
Student: Liu Qizhang
Tutor: Wang Naidong
 
Abstract: The DDD analysis's method calls the difference to demonstrate that through the edition EST which expresses in some kind of organization, carries on the biological information sciences analysis with other organization's in EST storehouse, seeks for new organization specificity EST the method. This research aims at this growth event's time spot, uses in US state-run biological technology message center (NCBI) the difference to demonstrate that the (DDD) analysis method, studies 8 cell early embryo and 4 cell embryo's gene expression difference, seeks for 8 cell time embryo tight densification and the pouch embryo's formation possible related gene and the regulative mechanism by this. This research screens 8 cell embryo gene using the DDD tool, and analyzes in the mammal early embryo growth 8 cell time gene expression change, seeks for 4 cell times to 8 cell time growth process possible related gene, is helpful in understands its gene expression mechanism.
Key Words: DDD; Early embryo; Gene
1 前言
随着各种模式生物基因组计划的深入和发展, 越来越多的基因组信息被释放出来, 利用网上的各种生物信息资源进行新基因克隆已经成为新兴的基因克隆策略, 表达序列标签也已经成为寻找未知功能新基因, 以及克隆不同时空差异基因和疾病相关新基因的重要标志物[1]。 以此为基础, 借助公共ESTs 数据库, 利用美国国立生物技术信息中心(NCBI) 的差异展示软件, 筛查小鼠8-细胞胚胎相关基因。
NCBI是指通过只有四个字母来代表DNA化学亚基的字母表,出现了生命过程的语法,其最复杂形式就是人类。阐明和使用这些字母来组成新的“单词和短语”是分子生物学领域的中心焦点。数目巨大的分子数据和这些数据的隐秘而精细的模式使得计算机化的数据库和分析方法成为绝对的必须。挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性,并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具,以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解[2,3]
哺乳动物附植前胚胎的发育受相应基因的调控,在不同的发育阶段表达不同的差异基因,筛选差异表达基因,有利于了解胚胎发育的分子机理。差别基因表达是哺乳动物胚胎发育过程中细胞分化的分子基础。在哺乳动物精卵结合形成合子至植入前的发育阶段, 发生的形态变化事件有原核形成、8 细胞期胚胎紧密化和囊胚的形成。紧密化发生在第3 次卵裂后不久,即8-细胞晚期[4]
如果胚胎没有在这个时期发生紧密化, 则该胚胎将不能正常发育成一个新个体。因此, 哺乳动物胚胎的紧密化过程必然受到某些机制的调控。在紧密化过程中胚胎细胞表面和细胞成份的分布均发生高度极化,形成顶区和基侧区。
胚胎细胞分化正是基于细胞极化和紧密化过程中形成的紧密连接。这些生命过程都离不开基因调控, 在早期胚胎紧密化发生前后的基因表达一定是变化的。研究表明胚胎细胞的分化,始于8-细胞时期的紧密化事件的发生, 寻找分离8-细胞晚期紧密化胚胎中特异性高表达基因是了解紧密化事件中基因调控的关键[5]
虽然近来发展的基因克隆技术能简便而有效的寻找差异表达基因, 但最大不足就是需要较多的起始材料, 尤其哺乳动物早期胚胎发育相关研究常常受到取材困难的制约, 因为收集足够数量的早期胚胎需耗费大量的时间、精力和经费。
序列表达标签(expressed sequence tag , EST)是指从不同组织来源的cDNA序列。这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域,并且取得了显著成效[6]。在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后,研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列,以便对该基因的功能进行研究。克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库,或采用PCR的方法,这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。而随着人类基因组计划的开展,在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据,如何充分利用这些已有的数据资源,加速人类基因克隆研究,同时避免重复工作,节省开支,已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前,采用生物信息学方法延伸表达序列标签(ESTs)序列,获得基因部分乃至全长cDNAycg,将为基因克隆和表达分析提供空前的动力,并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。另外EST也是一个基因的部分转录片段,通过构建EST 文库可以较大规模地获得基因表达信息,因此EST 策略是各物种基因组研究的主要方法,广泛应用于基因的预测、表达图谱的构建、芯片及表达差异的研究。但是通过生物学实验方法获取EST 费时费力,不仅受到通量和规模上的限制,更受到特定样本的制约,故难以全面反映相应组织或疾病基因表达的整体情况 [7]。与此相比,美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中收录的电子EST ,涉及了全身各组织及器官、不同生理或病理状态以及不同发育阶段,为研究提供了庞大而相对可靠的数据. NCBI的UniGene 则是一个将EST 的序列进行聚类的数据库,代表同一基因的不同EST 被归入同一UniGene,故一个UniGene 可以近似代表一个基因[8]。UniGene 数据库中包含了对基因的描述、基因代码、染色体定位等注释信息,为大规模地研究基因表达提供了支持。对这些数据库的整理和挖掘,将为生物医学的研究带来新思路、新信息。
EST序列的获取是利用计算机来协助克隆的第一步是必须获得感兴趣的EST,在dbEST数据库中找出EST的最有途径是寻找同源序列,标准:长度≥100bp,同源性50%以上、85%以下。可通过数个万维网界而使用BLAST检索程度实现,其中最常用的如NCBI(National Center for Biotechnology Information)的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine(包括EST提取者和EST组装机器)、THC(Tentative Human Consensus Sequences)数据库、ESTBlast检索程序——通过英国人类基因组作图项目资源中心(Human Genome Mapping Project Resource Center,HGMP—RC)服务器上访问[9]。然后将检出序列组装为重叠群(contig),以此重叠群为被检序列,重复进行BLAST检索与序列组装,延伸重叠样系列,重复以上过程,直到没有更多的重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸,有时可获得全长的基因编码序列。获得这些EST序列数据后,再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测,假如凤有精确匹配基因,将EST序列数据据EST六种阅读框翻译成蛋白质,接着与蛋白质序列数据库进行比较分析[11]。基因分析的结果大致有三种:第一是已知基因,是研究对象为人类已鉴定和了解的基因;第二是以前未经鉴定的新基因;第三是未知基因,这部分基因之间无同种或异种基因的匹配[10]。新基因和未知基因将进一步用于生物学研究。
DDD分析的方法又称差异展示,通过编辑在某种组织中表达的EST,与其他组织中的EST 库进行生物信息学分析,寻找新的组织特异性EST的方法.DDD 与传统的实验方法比较,更为经济、简便、快速,是一种高效寻找差异基因的新方法[12]
因此,本研究瞄准此发育事件的时间点,采用美国国立生物技术信息中心(NCBI)中差异展示(Digital Differential Display ,DDD) 分析方法,研究8 细胞早期胚胎及4细胞胚胎的基因表达差异, 以此来寻找8 细胞期胚胎紧密化和囊胚的形成可能的相关基因及调控机制。
2  方法
2.1  差异基因的筛选
    点击NCBI HomePage,在Serach栏中查找UniGene电击Go,在左边页面中电击DDD(差异展示法),然后在Species栏中选择Mus musculus,点击continue页面中就会展示许多的Lib.ID。
2.2  基因的显示
    实验是以4细胞胚胎cDNA 作为检测子(pool A),以8 细胞早期胚胎cDNA作为驱动子(pool B),通过差异展示方法(DDD)筛查只在8-细胞期有高表达而在4细胞无表达或低表达的特异EST,确定8-细胞期特异性表达基因。所以在Lib.IDpool A中选择4-cell stage embryo点击continue,在Pool B中选择8-cell stage embryo点击continue,将出现AB 2组序列表达基因,A组表示4细胞胚胎时期的序列基因,B组表示8细胞胚胎时期的序列基因,这2组序列基因就是需要查找的基因。
2.3  基因的筛选
    AB 2组基因序列下面大部分都有颜色深浅的小圆圈,2组基因进行比较颜色深的表示特异性基因或高表达的基因,颜色浅的表示低表达基因,没有小圆圈的表示胚胎时期无表达的基因。本实验所需要筛选的基因是在8细胞胚胎时期高表达和特异性的基因序列,即就是B组小圆圈颜色深的序列基因。
3  结果
我们选择7918 ESTs (NIA Mouse eight-cell-Embryo cDNA library)作为数据池(pool A), 8768 ESTs (NIA Mouse four-cell-Embryo cDNA library)作为数据池(pool B)。 2个文库的描述信息表明它们是在相同的条件下产生。 用pool A 和 pool B的比率来计算 Fold differences。结果显示8细胞阶段的69个基因的表达 高于4细胞阶段10倍以上。经过对DDD分析结果的筛选,获得小鼠8-细胞胚胎特异性基因45个,小鼠8-细胞胚胎高表达基因24个(见表1)。
表1 小鼠8-细胞胚胎相关基因的显示
Table 1  Gene discovery from 8 cell embryo based on digital differential display
筛选的基因
基因ID
 
小鼠8—细胞胚胎特异性基因
 
 
 
 
 
 
 
 
小鼠8—细胞胚胎高表达基因
 
 
 
共获得69条ESTs(expressed sequence tags)。其中,有41个ESTs(64%)分别与已知基因高度同源,21个ESTs(27%)分别与假想基因明显同源, 另有7个(9%)ESTs未发现与已知基因同源, 为新的ESTs片段。利用DDD工具中的基因染色体定位和基因描述功能对45个小鼠8-细胞胚胎特异性基因进一步的分析,获得了基因的相关描述信息(见表2)。其中酶活性蛋白基因占19%,转录及翻译调节因子基因占11%,结合蛋白、蛋白间相互作用蛋白/运输蛋白基因占24%,多能性相关基因占27%, 功能未基因占19%。
表2 小鼠8-细胞胚胎特异性基因的基因染色体定位和基因功能描述
Table2  Assigned mouse 8 cell embryo stage-specific genes
基因ID  
基因功能描述
染色体定位
MM.3496
MM.259705
MM.21596
MM.244209
MM.57286
MM.240830 
MM.294813
MM.34790
MM.218350
MM.350536 
MM.1104 
MM.137746
MM.276348
MM.271222
MM.86482  
 
MM.87532
MM.28838
MM.163339
MM.2817   
 
MM.157190 
MM.240310  
MM.2731
MM.11112 
MM.275426 
MM.280077
MM.272826
MM.11662 
 
MM.319836
MM.287359 
MM.168965 
MM.257149
 
MM.4206 
MM.222310
MM.28811
MM.279781 
MM.275127
MM.4505
MM.258320
MM.275188
 
MM.234437
MM.246493
MM.210343
MM.2863
 
MM.1843
MM.22130 
MM.28766 
MM.194486
MM.295168
MM.193925
MM.139695 
MM.28095 
farnesyltransferase; caax box; alpha
degradation,enhancer;mannosidase alpha-like 1
protein tyrosine phosphatase; receptor-type;
finteracting protein; binding protein 2
hippocampus abundant gene transcript 1
cdna sequence bc005561
zinc finger; fyve domain containing 27
nuclear receptor-binding set-domain protein 1
metal response element binding transcription factor 2
ran binding protein 10
cdna sequence bc053994
riken cdna d330037h05 gene
polymerase (rna) iii (dna directed) polypeptide g
cytochrome p450;family2;subfamily s;
polypeptide 1
8
4
6
10
13
15
4
7
17
8
X
5
12
11
12
19
 
2
3
14
7
 
10
4
11
7
15
3
3
1
 
5
19
13
5
 
8
6
15
13
8
16
3
7
 
10
11
X
9
 
3
12
      2
11
    1
15
11
    11
14
4  讨论
动物早期胚胎发育阻滞的分子机理一直是人们关注和研究的热点,哺乳动物合子基因组激活和植入前胚胎阶段特异性表达基因的研究一直是发育生物学研究的重点。发现和克隆植入前胚胎阶段特异性表达的基因需要有效的方法。哺乳动物植入前胚胎发育经历了受精卵分裂、合子基因组激活、聚集和囊胚形成等阶段。基因在植入前胚胎发育过程中精确的时空表达是胚胎正常发育和生长的前提。研究不同发育阶段基因激活和表达模式,可以提供植入前胚胎正常发育相关的重要基因信息,也可以提供异常发育时这些基因的表达变化。阶段特异性基因表达模式的研究可以进一步说明这些特异性基因的功能和作用。由单个植入前胚胎构建的阶段特异性cDNA 文库是一种代表阶段性基因表达活性的资源库,也是一种研究阶段性基因表达模式有价值的工具。
李汶等在研究哺乳动物8细胞胚胎的紧密化及紧密化前后基因表达谱的变化中发现, 联合采用SMART-PCR(switching mechanism at5′end of the RNA transcript-PCR)和抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以8细胞紧密化胚胎cDNA作为检测子,以8细胞早期胚胎cDNA作为驱动子,研究8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达差异。结果:共获得478个阳性克隆;进一步分析384个克隆,共获得83条ESTs(expressed sequence tags)。其中,有51个ESTs(61%)分别与36个已知基因高度同源, 27个ESTs(33%)分别与7个假想基因明显同源,另有5个(6%)ESTs未发现与已知基因同源,为新的ESTs片段。而本研究获得69条ESTs(expressed sequence tags)。其中,有41个ESTs(64%)分别与已知基因高度同源,21个ESTs(27%)分别与假想基因明显同源, 另有7个(9%)ESTs未发现与已知基因同源, 为新的ESTs片段。
缺乏足够的实验材料和有效的实验技术一直是阻碍研究哺乳动物植入前胚胎发育的主要因素。 目前, mRNA 差异显示(mRNA differential displaypolymerase chain reaction , DDDRT2PCR) 是识别和分离发育相关基因的主要技术。在用DDRT-PCR 方法分析小鼠早期胚胎发育不同时期差别表达基因的研究中发现,最困难的是起始材料量严重不足,每只雌性小鼠经超排处理后大约可得到30 枚卵,1 枚小鼠的未受精卵中总RNA 的量为0.143 ng,1个22细胞胚胎中是0.135 ng , 而在42细胞胚中也仅为0.160 ng ,因此,要获得微克级的RNA 极为困难,而生物信息学方法利用网络资源(植入前胚胎构建的阶段特异性cDNA 文库)分析预测动物早期胚胎基因,可解决起始材料量严重不足的问题,其结果对进一步的实验验证和发现提供了丰富的信息基础。但是迄今为止,无论是胚胎细胞克隆还是体细胞克隆,获得存活个体的数量并不多,克隆效率比较低,而且还常常伴有一些系统或器官的畸形发育。这主要是再程序化(reprogramming) 过程不能够顺利而正确进行的结果,因此研究植入前克隆胚胎的基因表达模式对提高克隆效率和减少畸形的发生十分重要。RT-PCR 是目前研究植入前胚胎基因表达模式的有效手段,但是它的缺点是只能针对已知的基因进行研究,并且每次只能进行一个基因的研究。这对于研究植入前胚胎发育所需基因的表达来说是远远不够的。 而在体细胞核移植之后,克隆的哺乳动物植入前胚胎存在相当多的基因表达异常现象。 而且这种异常的表达往往是随机发生的,这就更加需要用单个的植入前克隆胚胎来建立期特异性的cDNA 文库,以便进行系统而精确地研究,发现特异表达的再程序化相关基因,从而为深入了解克隆胚胎基因表达模式的理解,通过DDD可以利用足够的cDNA 以进行示差杂交、减法扣除和差别显示。
本文利用DDD工具分离到45 小鼠8-细胞胚胎特异性基因,在45个早期发育相关的基础之上,对它们的染色体定位的信息进行总结,对它们在这一阶段功能进行了推测, 为进一步深入实验验证和研究这些基因的功能以及它们在MZT、ZGA以及植入前发育中的具体作用奠定了基础。
5  结论
本研究共获得69条ESTs(expressed sequence tags)。其中,有41个ESTs(64%)分别与已知基因高度同源,21个ESTs(27%)分别与假想基因明显同源, 另有7个(9%)ESTs未发现与已知基因同源, 为新的ESTs片段。获得了基因的相关描述信息(见表2)。其中酶活性蛋白基因占19%,转录及翻译调节因子基因占11%,结合蛋白、蛋白间相互作用蛋白/运输蛋白基因占24%,多能性相关基因占27%, 功能未知基因占19%。
 
 
 
 
 
 
参考文献
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